منضدة التقنية الحيوية – التحول البكتيري والقطع بإنزيمات القطع والفصل الكهربائي الهلامي
الأحياءالتقانة الحيوية17–18 سنةمختبر افتراضي
جارٍ التحميل…
سجّل الدخول للتشغيلتجربتان عمليتان في الهندسة الوراثية على منضدة افتراضية واحدة. حوّل بكتيريا E. coli ببلازميد يحمل جين مقاومة الأمبيسلين وجين GFP يُحفَّز بالأرابينوز (CaCl₂، الثلج، صدمة حرارية عند 42 °C، الاستشفاء)، وانشر العينات على أطباق LB وLB/amp وLB/amp/ara، واحضنها بتصوير متسارع، وعُدّ المستعمرات، وافحصها تحت الأشعة فوق البنفسجية، واحسب كفاءة التحول خطوة خطوة. ثم اقطع DNA العاثية والبلازميد بالإنزيمات EcoRI وBamHI وHindIII، وحمّل هلام الأغاروز وشغّله، ولوّنه، وقِس مسافات الحزم، وارسم منحنى معياريًا لـ log(bp) من سلم DNA، واقرأ منه أحجام القطع.
الدرس: الهندسة الوراثية: التحول البكتيري وإنزيمات القطع والفصل الكهربائي لـ DNA في هلام الأغاروز
ماذا تعرض
ينقل مهندسو الوراثة الجينات إلى البكتيريا ويفحصون DNA بقطعه. في تبويب التحول يسمح CaCl₂ وصدمة حرارية عند 42 °C لبكتيريا E. coli بأخذ بلازميد يحمل جين مقاومة الأمبيسلين (bla) وجين GFP يُشغَّل بالأرابينوز. لا تنمو على الأمبيسلين إلا الخلايا المتحولة، ولا تتوهج بالأخضر تحت الأشعة فوق البنفسجية إلا بوجود الأرابينوز. وفي تبويب الهلام تقطع إنزيمات القطع DNA عند تسلسلات التعرف الخاصة بها؛ وتتحرك القطع السالبة الشحنة عبر الأغاروز نحو القطب الموجب، وتقطع القطع الأصغر مسافة أكبر. ويعطي منحنى معياري للوغاريتم الحجم مقابل المسافة لسلم DNA أحجامَ القطع المجهولة.
طريقة الاستخدام
في «1. التحول» اضغط أزرار الخطوات بالترتيب، أو استخدم «تخطَّ هذه الخطوة» لترك الثلج أو الصدمة الحرارية أو الاستشفاء. بعد «احضن عند 37 °C» اضبط مدة الحضن، وشغّل «أشعة فوق بنفسجية»، وانقر طبقًا لتكبيره، وانقر المستعمرات لعدّها؛ فيكتمل حساب الكفاءة. في «2. القطع والهلام» اختر DNA والإنزيمات لكل مسار، ثم «اقطع عند 37 °C» و«حمّل الآبار» و«شغّل الهلام» و«لوّن واعرض». انقر الحزم لقياسها واقرأ أحجامها من المنحنى المعياري.
المعاملات القابلة للتغيير
- التبويب الافتتاحي التحول البكتيري, القطع بالإنزيمات والهلام
- تركيز البلازميد 0.02–0.2 µg/µL
- مدة الصدمة الحرارية عند 42 °C 0–120 s
- الحجم المنشور على كل طبق 50–250 µL
- DNA المراد قطعه DNA عاثية خطي (20,000 bp), بلازميد GFP دائري (5,400 bp)
- جهد الهلام 50–150 V
- مدة تشغيل الهلام 10–90 min
أسئلة للاستكشاف
- لماذا تكوّن الخلايا الخالية من البلازميد بساطًا على LB ولا تكوّن مستعمرات على LB/amp؟
- لماذا تتوهج المستعمرات تحت الأشعة فوق البنفسجية على LB/amp/ara ولا تتوهج على LB/amp، مع أن عددها متقارب في الطبقين؟
- كم قطعة تعطي ثلاثة مواضع قطع في DNA خطي، وكم قطعة في بلازميد دائري؟
