Bancada de biotecnologia – transformação, digestão com enzimas de restrição e gel
BiologiaBiotecnologiaIdades 17–18
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Entre para usarDuas práticas de engenharia genética em uma bancada virtual. Transforme E. coli com um plasmídeo que carrega um gene de resistência à ampicilina e um gene GFP induzível por arabinose (CaCl₂, gelo, choque térmico a 42 °C, recuperação), semeie placas LB, LB/amp e LB/amp/ara, incube em time-lapse, conte colônias, observe-as sob luz UV e calcule passo a passo a eficiência de transformação. Depois digira DNA de fago e o plasmídeo com EcoRI, BamHI e HindIII, carregue e corra um gel de agarose, core-o, meça a distância das bandas, monte uma curva-padrão log(pb) com o marcador de DNA e leia o tamanho dos fragmentos.
Aula: Engenharia genética: transformação bacteriana, enzimas de restrição e eletroforese de DNA em gel de agarose
O que mostra
A engenharia genética coloca genes em bactérias e confere o DNA cortando-o. Na aba de transformação, o CaCl₂ e um choque térmico a 42 °C fazem a E. coli captar um plasmídeo com um gene de resistência à ampicilina (bla) e um gene GFP ativado pela arabinose. Só as células transformadas crescem com ampicilina, e só brilham em verde sob UV quando há arabinose. No gel, enzimas de restrição cortam o DNA nas suas sequências de reconhecimento; os fragmentos, de carga negativa, migram para o eletrodo positivo, e os menores vão mais longe. Uma curva-padrão do marcador dá o tamanho dos fragmentos desconhecidos.
Como usar
Em 1. Transformação, aperte os botões das etapas em ordem ou use Pular esta etapa para deixar de fora o gelo, o choque térmico ou a recuperação. Depois de Incubar a 37 °C, ajuste o tempo de incubação, ligue Luz UV, toque em uma placa para ampliá-la e toque nas colônias para contá-las. Em 2. Digestão e gel, escolha o DNA e as enzimas de cada canaleta e use Digerir a 37 °C, Carregar poços, Correr o gel e Corar e ver. Toque nas bandas para medi-las.
Parâmetros que você pode mudar
- Aba inicial Transformação bacteriana, Digestão e gel
- Concentração de plasmídeo 0,02–0,2 µg/µL
- Tempo de choque térmico a 42 °C 0–120 s
- Volume semeado em cada placa 50–250 µL
- DNA a digerir DNA de fago linear (20.000 pb), Plasmídeo GFP circular (5.400 pb)
- Tensão do gel 50–150 V
- Tempo de corrida do gel 10–90 min
Perguntas para explorar
- Por que células sem plasmídeo formam um tapete em LB, mas nenhuma colônia em LB/amp?
- Por que as colônias brilham sob UV em LB/amp/ara, mas não em LB/amp, se as duas placas têm contagens parecidas?
- Quantos fragmentos três cortes geram em um DNA linear, e quantos em um plasmídeo circular?
