Biotech-Labortisch – Transformation, Restriktionsverdau und Gel
BiologieBiotechnologieAlter 17–18
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Zum Starten anmeldenZwei gentechnische Praktika an einem virtuellen Labortisch. Transformieren Sie E. coli mit einem Plasmid, das ein Ampicillin-Resistenzgen und ein durch Arabinose induzierbares GFP-Gen trägt (CaCl₂, Eis, Hitzeschock bei 42 °C, Erholung), plattieren Sie auf LB-, LB/amp- und LB/amp/ara-Platten aus, bebrüten Sie im Zeitraffer, zählen Sie Kolonien, betrachten Sie sie unter UV-Licht und berechnen Sie Schritt für Schritt die Transformationseffizienz. Verdauen Sie danach Phagen-DNA und das Plasmid mit EcoRI, BamHI und HindIII, beladen Sie ein Agarosegel und lassen Sie es laufen, färben Sie es, messen Sie die Laufstrecken der Banden, erstellen Sie aus dem DNA-Größenstandard eine Eichkurve log(bp) und lesen Sie die Fragmentgrößen ab.
Lektion: Gentechnik: bakterielle Transformation, Restriktionsenzyme und Agarose-Gelelektrophorese von DNA
Was sie zeigt
In der Gentechnik werden Gene in Bakterien eingebracht und DNA durch Schneiden überprüft. Im Tab Transformation sorgen CaCl₂ und ein Hitzeschock bei 42 °C dafür, dass E. coli ein Plasmid mit einem Ampicillin-Resistenzgen (bla) und einem durch Arabinose eingeschalteten GFP-Gen aufnimmt. Nur transformierte Zellen wachsen auf Ampicillin, und sie leuchten unter UV-Licht nur dann grün, wenn Arabinose vorhanden ist. Im Tab Gel schneiden Restriktionsenzyme die DNA an ihren Erkennungssequenzen; die negativ geladenen Fragmente wandern durch die Agarose zur positiven Elektrode, kleinere Fragmente weiter. Eine Eichkurve log(Größe) gegen Laufstrecke des Größenstandards liefert die Größe unbekannter Fragmente.
So funktioniert es
Drücken Sie in 1. Transformation die Schritt-Schaltflächen der Reihe nach oder lassen Sie mit Schritt überspringen Eis, Hitzeschock oder Erholung weg. Stellen Sie nach Bei 37 °C bebrüten die Bebrütungszeit ein, schalten Sie UV-Licht ein, tippen Sie eine Platte zum Vergrößern an und tippen Sie Kolonien zum Zählen an; die Effizienzberechnung füllt sich. Wählen Sie in 2. Verdau und Gel DNA und Enzyme je Spur, dann Verdau bei 37 °C, Taschen beladen, Gel laufen lassen und Färben und ansehen. Tippen Sie Banden zum Messen an.
Einstellbare Parameter
- Start-Tab Bakterielle Transformation, Restriktionsverdau und Gel
- Plasmidkonzentration 0,02–0,2 µg/µL
- Hitzeschockdauer bei 42 °C 0–120 s
- Ausplattiertes Volumen je Platte 50–250 µL
- Zu verdauende DNA Lineare Phagen-DNA (20.000 bp), Ringförmiges GFP-Plasmid (5.400 bp)
- Gelspannung 50–150 V
- Laufzeit des Gels 10–90 min
Fragen zum Erkunden
- Warum bilden Zellen ohne Plasmid auf LB einen Rasen, auf LB/amp aber keine Kolonien?
- Warum leuchten Kolonien unter UV auf LB/amp/ara, aber nicht auf LB/amp, obwohl beide Platten ähnlich viele haben?
- Wie viele Fragmente ergeben drei Schnitte in linearer DNA und wie viele in einem ringförmigen Plasmid?
