Paillasse de biotechnologie – transformation, digestion par enzymes de restriction et gel
BiologieBiotechnologies17–18 ans
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Connectez-vous pour lancerDeux travaux pratiques de génie génétique sur une paillasse virtuelle. Transformez E. coli avec un plasmide portant un gène de résistance à l'ampicilline et un gène GFP inductible par l'arabinose (CaCl₂, glace, choc thermique à 42 °C, récupération), étalez sur boîtes LB, LB/amp et LB/amp/ara, incubez en accéléré, comptez les colonies, observez-les sous UV et calculez pas à pas l'efficacité de transformation. Digérez ensuite un ADN de phage et le plasmide par EcoRI, BamHI et HindIII, déposez et faites migrer un gel d'agarose, colorez-le, mesurez la distance des bandes, tracez une courbe d'étalonnage log(pb) avec le marqueur de taille et lisez la taille des fragments.
Leçon : Génie génétique : transformation bactérienne, enzymes de restriction et électrophorèse de l'ADN sur gel d'agarose
Ce qu’elle montre
Le génie génétique fait entrer des gènes dans des bactéries et contrôle l'ADN en le coupant. Dans l'onglet transformation, le CaCl₂ et un choc thermique à 42 °C permettent à E. coli d'absorber un plasmide portant un gène de résistance à l'ampicilline (bla) et un gène GFP activé par l'arabinose. Seules les cellules transformées poussent sur ampicilline, et elles ne brillent en vert sous UV qu'avec l'arabinose. Dans le gel, les enzymes de restriction coupent l'ADN à leurs séquences de reconnaissance ; les fragments, chargés négativement, migrent vers l'électrode positive, les plus petits plus loin. Une courbe d'étalonnage du marqueur donne la taille des fragments inconnus.
Mode d’emploi
Dans 1. Transformation, appuyez sur les boutons des étapes dans l'ordre ou utilisez Sauter cette étape pour supprimer la glace, le choc thermique ou la récupération. Après Incuber à 37 °C, réglez la durée d'incubation, allumez Lumière UV, touchez une boîte pour l'agrandir et touchez les colonies pour les compter. Dans 2. Digestion et gel, choisissez l'ADN et les enzymes de chaque piste, puis Digérer à 37 °C, Charger les puits, Lancer le gel et Colorer et observer. Touchez les bandes pour les mesurer.
Paramètres modifiables
- Onglet de départ Transformation bactérienne, Digestion et gel
- Concentration du plasmide 0,02–0,2 µg/µL
- Durée du choc thermique à 42 °C 0–120 s
- Volume étalé sur chaque boîte 50–250 µL
- ADN à digérer ADN de phage linéaire (20 000 pb), Plasmide GFP circulaire (5 400 pb)
- Tension du gel 50–150 V
- Durée de migration 10–90 min
Questions à explorer
- Pourquoi les cellules sans plasmide forment-elles un tapis sur LB mais aucune colonie sur LB/amp ?
- Pourquoi les colonies brillent-elles sous UV sur LB/amp/ara mais pas sur LB/amp, alors que les comptages sont proches ?
- Combien de fragments donnent trois coupures dans un ADN linéaire, et combien dans un plasmide circulaire ?
