PCR – Vervielfältigung von DNA durch Temperaturzyklen
BiologieBiotechnologieAlter 17–18
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Als Nächstes in Biotechnologie
Jeder PCR-Zyklus besteht aus Denaturierung bei 95 °C, Anlagerung der Primer (Hybridisierung) und Elongation bei 72 °C und verdoppelt die Zahl der Kopien des Ziel-DNA-Abschnitts. Verändern Sie die Zahl der Zyklen, die Hybridisierungstemperatur im Verhältnis zur Schmelztemperatur der Primer und die Anfangszahl der Kopien, um zu sehen, wie die exponentielle Kurve in ein Plateau übergeht, die Bande im Gel heller wird und bei zu niedriger Hybridisierungstemperatur eine unspezifische Nebenbande erscheint – die Grundlage von PCR-Tests und DNA-Analysen in der Forensik.
Lektion: Molekularbiologie
Was sie zeigt
Die Polymerase-Kettenreaktion kopiert einen kurzen Ziel-Abschnitt der DNA. In jedem Temperaturzyklus trennen sich die beiden Stränge, zwei Primer binden an den Enden des Zielabschnitts, und eine hitzestabile Polymerase synthetisiert neue komplementäre Stränge, sodass sich die Kopienzahl im Idealfall verdoppelt: N = N₀·2ⁿ nach n Zyklen. Die Kurve flacht dann ab, wenn Primer, Nucleotide und Enzym verbraucht sind. Die Spezifität hängt von der Hybridisierungstemperatur im Vergleich zur Schmelztemperatur des Primers ab (hier etwa 60 °C), und der Zyklus, in dem das Signal die Nachweisgrenze überschreitet, der Ct-Wert, spiegelt die Ausgangsmenge an Ziel-DNA wider.
So funktioniert es
Klicken Sie auf „Einen Zyklus zeigen ▶“, um Denaturierung, Hybridisierung und Elongation im Feld Temperaturprogramm zu verfolgen. Erhöhen Sie dann die Anzahl der Zyklen und beobachten Sie die Kopienkurve und die Gelbande. Stellen Sie die Hybridisierungstemperatur deutlich über und deutlich unter 60 °C ein und vergleichen Sie die Probenspur. Senken Sie zum Schluss die Anfangszahl der DNA-Kopien (log) schrittweise und notieren Sie, wie sich der Ct-Wert ändert.
Einstellbare Parameter
- Anzahl der Zyklen 0–40
- Hybridisierungstemperatur 40–70 °C
- Anfangszahl der DNA-Kopien (log) 0–6
Fragen zum Erkunden
- Warum verdoppelt sich die Kopienzahl nach etwa 30 Zyklen nicht mehr?
- Was geschieht mit dem Produkt und der Gelbande, wenn die Hybridisierungstemperatur deutlich über der Schmelztemperatur des Primers liegt?
- Wie ändert sich der Ct-Wert, wenn die Ausgangsmenge an DNA auf ein Zehntel sinkt, und warum?
