Praktikum Virtual Bioteknologi: Transformasi dan Gel Agarosa

Praktikum virtual bioteknologi ini mencakup dua investigasi AP Biology di satu meja: transformasi bakteri dan analisis DNA dengan enzim restriksi. Di tab pertama, siswa mentransformasi E. coli dengan plasmid yang membawa gen resistansi ampisilin dan gen GFP yang dinyalakan oleh arabinosa. Mereka mengamati enam cawan di bawah cahaya biasa dan sinar UV, lalu menghitung efisiensi transformasi. Di tab kedua, mereka memotong DNA dengan EcoRI, BamHI, dan HindIII, menjalankan gel agarosa, dan menentukan ukuran fragmen dari kurva standar penanda DNA. Setiap angka di bawah dibaca dari simulasi.

Keterkaitan dengan kurikulum

• AP Biology: Unit 6 (Gene Expression and Regulation), topik 6.8 Biotechnology (IST-1.P), dengan saklar arabinosa sebagai contoh regulasi gen (topik 6.5). Praktikum ini sesuai dengan investigasi AP tentang transformasi bakteri dan analisis enzim restriksi (Lab 8 dan 9).
• Simulic tidak berafiliasi dengan College Board maupun AQA dan tidak didukung oleh keduanya.

Sebelum praktikum (5 menit)

Tanyakan: "E. coli dari tabung + plasmid dan − plasmid disebar pada cawan LB, LB/amp, dan LB/amp/ara. Cawan mana yang koloninya berpendar hijau di bawah sinar UV?" Siswa memberi satu alasan. Pada tautan kelas, ini adalah pertanyaan 1; simulasi terbuka setelah mereka menjawab.

Langkah kerja dalam simulasi

Bagian A: transformasi. Pertahankan nilai awal: plasmid 0,08 µg/µL, kejut panas 50 s, 100 µL per cawan.

1. Di 1. Transformasi, tekan setiap tombol langkah secara berurutan, dari Tambah CaCl₂ sampai Inkubasi 37 °C. Baca pesan setelah setiap langkah.
2. Seret Waktu inkubasi ke 24 jam.
3. Catat pertumbuhan di keenam cawan. Tekan Sinar UV dan catat cawan mana yang berpendar.
4. Ketuk cawan + plasmid LB/amp/ara, lalu ketuk setiap koloni untuk menghitungnya, atau tekan Hitungkan. Tekan Kembali ke 6 cawan dan hitung juga cawan + plasmid LB/amp.
5. Baca efisiensinya di bawah Efisiensi transformasi, dari cawan LB/amp/ara.

Cawan	Pertumbuhan	Di bawah UV	Koloni terhitung
+ plasmid, LB
+ plasmid, LB/amp
+ plasmid, LB/amp/ara
− plasmid, LB
− plasmid, LB/amp
− plasmid, LB/amp/ara

Bagian B: pemotongan dan gel. Pertahankan 100 V, 40 menit, dan DNA fag. Lajur 1 berisi penanda DNA; lajur 2–6 berisi DNA fag tidak dipotong, + EcoRI, + BamHI, + HindIII, + EcoRI + BamHI.

1. Di 2. Pemotongan dan gel, tekan Potong pada 37 °C, Muat sumur, Jalankan gel, lalu Warnai dan lihat.
2. Tekan Ukurkan penanda untuk memplot kurva standar.
3. Ketuk setiap pita di lajur 3–5. Tabel sampel menampilkan jaraknya d dan ukurannya dari kurva.

Lajur	Enzim	Jumlah pita	d (mm)	Ukuran dari kurva (pb)
3	EcoRI
4	BamHI
5	HindIII

Hasil yang diharapkan

Transformasi. Kedua cawan LB ditumbuhi hamparan, dan kedua cawan ampisilin − plasmid tetap kosong. Cawan + plasmid LB/amp dan LB/amp/ara ditumbuhi koloni terpisah dalam jumlah yang mirip. Di bawah UV, hanya koloni LB/amp/ara yang berpendar hijau. Satu percobaan uji memberi 67 dan 70 koloni.

Perhitungannya: 0,80 µg plasmid dalam 510 µL, 100 µL disebar, jadi cawan menerima 0,157 µg. Lalu 70 ÷ 0,157 ≈ 450 transforman/µg. Jumlah koloni bervariasi acak di sekitar 73 per cawan, jadi sebagian besar percobaan memberi 300 sampai 650 transforman/µg. Melewatkan kejut panas menyisakan sekitar sepersepuluh koloni.

Gel. Penanda DNA membentang dari 17,0 mm (10.000 pb) sampai 54,0 mm (250 pb). Kurvanya log₁₀(pb) = 4,695 − 0,0411·d (R² = 0,996, 13 titik). EcoRI memotong DNA fag dua kali, sehingga memberi 3 pita pada 18,5, 20,0, dan 25,5 mm. Kurva membacanya sebagai 8.590, 7.450, dan 4.430 pb; ukuran sebenarnya 8.700, 7.100, dan 4.200 pb. BamHI (3 situs) memberi 4 pita dan HindIII (4 situs) memberi 5. Titik 250 pb berada di bawah garis lurus: seperti pada gel sungguhan, kurvanya melengkung di kedua ujung, jadi bacalah ukuran dari bagian tengahnya yang lurus.

Pertanyaan untuk siswa

1. Prediksi: cawan mana yang koloninya berpendar hijau di bawah sinar UV?
2. Cawan mana yang menunjukkan bahwa ampisilin membunuh sel tanpa plasmid?
3. Hitung koloni cawan + plasmid LB/amp/ara. Berapa efisiensi transformasinya?
4. DNA fag + EcoRI: berapa ukuran pita yang paling jauh dari sumur?
5. Jelaskan mengapa DNA bergerak ke elektrode positif, dan mengapa fragmen yang lebih kecil bergerak lebih jauh.

Jawaban untuk guru:

1. Hanya cawan + plasmid LB/amp/ara.
2. − plasmid, LB/amp.
3. Sekitar 450 transforman/µg; jawaban berapa pun dari 250 sampai 700 diterima.
4. Sekitar 4.400 pb (sebenarnya 4.200); 3.900 sampai 4.700 pb diterima.
5. Gugus fosfat membuat DNA bermuatan negatif, sehingga DNA bergerak ke elektrode positif. Gel agarosa adalah jaring berpori: fragmen kecil lebih mudah menyelinap, sehingga bergerak lebih jauh dalam waktu yang sama.

Miskonsepsi umum

• "Arabinosa membuat bakteri resistan." Resistansi berasal dari gen bla pada plasmid. Arabinosa hanya menyalakan gen GFP.
• "Tidak berpendar pada LB/amp berarti sel tidak punya gen GFP." Gennya ada, tetapi tidak diekspresikan tanpa arabinosa.
• "Tiga potongan selalu menghasilkan tiga potong DNA." DNA linear yang dipotong di n situs menghasilkan n + 1 fragmen; plasmid sirkular menghasilkan n.
• "Fragmen yang lebih besar lebih gelap karena molekulnya lebih besar." Kepekatan pita mengikuti massa DNA, jadi fragmen kecil membawa lebih sedikit DNA dan tampak lebih pudar.

Pengayaan

• Optimalkan kejut panas. Jalankan Percobaan baru dengan lama kejut panas dari 0 sampai 120 s dan plot jumlah koloninya. Puncaknya di dekat 50 s.
• Petakan plasmid. Atur satu lajur ke Plasmid GFP + BamHI. Dua situs memberi 2 fragmen, 1.800 dan 3.600 pb. Tanyakan mengapa plasmid yang tidak dipotong memberi dua pita yang ukurannya tidak dapat dibaca dari penanda.

Pertanyaan umum

Apakah ini menggantikan praktikum nyata?

Simulasi ini menggantikan bagian yang sering tidak dapat dilakukan sekolah: tidak ada bakteri hasil rekayasa genetika, tidak ada sinar UV, dan tidak ada pewarna DNA. Pakai untuk merencanakan, melatih perhitungan, atau sebagai pengganti praktikum yang tidak dapat Anda jalankan. Lihat laboratorium virtual vs laboratorium fisik.

Mengapa jumlah koloni tiap siswa berbeda?

Sel mana yang mengambil plasmid bersifat acak, seperti di laboratorium sungguhan. Gabungkan hasil kelas dan hitung efisiensi rata-ratanya.

Bisakah saya mengunci pengaturan untuk kelas saya?

Bisa. Di halaman Bagikan, buat tautan lalu atur konsentrasi plasmid, lama kejut panas, volume, sampel DNA, tegangan, dan lama elektroforesis pada nilai awal.

Terkait

PCR – memperbanyak DNA dengan siklus suhu Ekspresi gen – transkripsi, translasi, dan regulasi

Untuk regulasi gen, lihat RPP ekspresi gen. Untuk teknik aseptik, lihat praktikum virtual zona hambat.