Laboratório virtual de biotecnologia: transformação e gel

Este laboratório virtual de biotecnologia reúne duas investigações do AP Biology numa só bancada: transformação bacteriana e análise de DNA com enzimas de restrição. Na primeira aba, os alunos transformam E. coli com um plasmídeo que carrega um gene de resistência à ampicilina e um gene GFP ligado pela arabinose. Eles leem seis placas sob luz ambiente e luz UV e calculam a eficiência de transformação. Na segunda aba, cortam DNA com EcoRI, BamHI e HindIII, correm um gel de agarose e medem o tamanho dos fragmentos pela curva-padrão de um marcador. Todos os números abaixo foram lidos na simulação.

Alinhamento com o currículo

• AP Biology: Unidade 6 (Gene Expression and Regulation), tópico 6.8 Biotechnology (IST-1.P), com o interruptor da arabinose como exemplo de regulação gênica (tópico 6.5). Corresponde às investigações do AP de transformação bacteriana e de análise com enzimas de restrição (Labs 8 e 9).
• O Simulic não é afiliado ao College Board nem à AQA, nem endossado por eles.

Antes do laboratório (5 min)

Pergunte: "E. coli dos tubos + plasmídeo e − plasmídeo é semeada em placas LB, LB/amp e LB/amp/ara. Quais placas terão colônias que brilham em verde sob luz UV?" Os alunos dão um motivo. Num link de turma, esta é a pergunta 1; a simulação é liberada depois que eles respondem.

Método na simulação

Parte A: transformação. Mantenha os valores iniciais: plasmídeo 0,08 µg/µL, choque térmico 50 s, 100 µL por placa.

1. Em 1. Transformação, clique em cada botão de etapa na ordem, de Adicionar CaCl₂ até Incubar a 37 °C. Leia a mensagem depois de cada etapa.
2. Arraste Tempo de incubação até 24 h.
3. Registre o crescimento nas seis placas. Clique em Luz UV e registre quais placas brilham.
4. Toque na placa + plasmídeo LB/amp/ara e depois toque em cada colônia para contá-la, ou clique em Contar para mim. Clique em Voltar às 6 placas e conte também a placa + plasmídeo LB/amp.
5. Leia a eficiência em Eficiência de transformação, calculada pela placa LB/amp/ara.

Placa	Crescimento	Sob UV	Colônias contadas
+ plasmídeo, LB
+ plasmídeo, LB/amp
+ plasmídeo, LB/amp/ara
− plasmídeo, LB
− plasmídeo, LB/amp
− plasmídeo, LB/amp/ara

Parte B: digestão e gel. Mantenha 100 V, 40 min e DNA de fago. A canaleta 1 tem o marcador; as canaletas 2–6 têm DNA de fago não cortado, + EcoRI, + BamHI, + HindIII, + EcoRI + BamHI.

1. Em 2. Digestão e gel, clique em Digerir a 37 °C, Carregar poços, Correr o gel e depois Corar e ver.
2. Clique em Medir o marcador para mim para traçar a curva-padrão.
3. Toque em cada banda das canaletas 3–5. A tabela de amostras mostra a distância d dela e o tamanho lido na curva.

Canaleta	Enzima	Número de bandas	d (mm)	Tamanho pela curva (pb)
3	EcoRI
4	BamHI
5	HindIII

Resultados esperados

Transformação. As duas placas LB formam um tapete, e as duas placas − plasmídeo com ampicilina ficam vazias. As placas + plasmídeo LB/amp e LB/amp/ara formam colônias isoladas em números parecidos. Sob UV, só as colônias de LB/amp/ara brilham em verde. Um ensaio de teste deu 67 e 70 colônias.

A conta: 0,80 µg de plasmídeo em 510 µL, 100 µL semeados, então a placa recebeu 0,157 µg. Então 70 ÷ 0,157 ≈ 450 transformantes/µg. As contagens variam ao acaso em torno de 73 por placa, então a maioria dos ensaios dá de 300 a 650 transformantes/µg. Pular o choque térmico deixa cerca de um décimo das colônias.

Gel. O marcador vai de 17,0 mm (10.000 pb) a 54,0 mm (250 pb). A curva é log₁₀(pb) = 4,695 − 0,0411·d (R² = 0,996, 13 pontos). A EcoRI corta o fago duas vezes e dá 3 bandas, a 18,5, 20,0 e 25,5 mm. A curva as lê como 8.590, 7.450 e 4.430 pb; os tamanhos reais são 8.700, 7.100 e 4.200 pb. A BamHI (3 sítios) dá 4 bandas e a HindIII (4 sítios) dá 5. O ponto de 250 pb fica abaixo da reta: como num gel real, a curva se dobra nas duas pontas, então leia os tamanhos na parte central, que é reta.

Perguntas para os alunos

1. Previsão: quais placas terão colônias que brilham em verde sob luz UV?
2. Qual placa mostra que a ampicilina mata as células sem o plasmídeo?
3. Conte a placa + plasmídeo LB/amp/ara. Qual é a eficiência de transformação?
4. DNA de fago + EcoRI: qual é o tamanho da banda mais distante do poço?
5. Explique por que o DNA se move para o eletrodo positivo e por que os fragmentos menores vão mais longe.

Respostas para o professor:

1. Só a placa + plasmídeo LB/amp/ara.
2. − plasmídeo, LB/amp.
3. Cerca de 450 transformantes/µg; aceita-se qualquer resposta de 250 a 700.
4. Cerca de 4.400 pb (real 4.200); aceita-se de 3.900 a 4.700 pb.
5. Os grupos fosfato deixam o DNA negativo, então ele se move para o eletrodo positivo. O gel de agarose é uma malha de poros: fragmentos pequenos passam com mais facilidade, então vão mais longe no mesmo tempo.

Erros conceituais comuns

• "A arabinose deixou as bactérias resistentes." A resistência vem do gene bla do plasmídeo. A arabinose só liga o gene GFP.
• "Sem brilho em LB/amp quer dizer que as células não têm o gene GFP." O gene está lá, mas não é expresso sem arabinose.
• "Três cortes sempre dão três pedaços." Um DNA linear cortado em n sítios dá n + 1 fragmentos; um plasmídeo circular dá n.
• "Fragmentos maiores ficam mais escuros porque são moléculas maiores." A intensidade da banda acompanha a massa de DNA, então um fragmento pequeno carrega menos DNA e parece mais fraco.

Extensão

• Otimizar o choque térmico. Faça um Novo experimento com tempos de choque térmico de 0 a 120 s e trace o gráfico do número de colônias. Ele tem um pico perto de 50 s.
• Mapear o plasmídeo. Ajuste uma canaleta para Plasmídeo GFP + BamHI. Dois sítios dão 2 fragmentos, de 1.800 e 3.600 pb. Pergunte por que o plasmídeo não cortado dá duas bandas cujo tamanho não pode ser lido pelo marcador.

Perguntas frequentes

Isso substitui o laboratório real?

Substitui as partes que as escolas muitas vezes não conseguem fazer: sem bactérias geneticamente modificadas, sem luz UV e sem corante de DNA. Use para planejar, para treinar as contas ou no lugar de um laboratório que você não pode fazer. Veja laboratórios virtuais vs. laboratórios reais.

Por que os alunos obtêm contagens de colônias diferentes?

Quais células captam o plasmídeo é aleatório, como num laboratório real. Junte os resultados da turma e calcule uma eficiência média.

Posso fixar as configurações para a minha turma?

Sim. Na página Compartilhar, crie um link e defina a concentração de plasmídeo, o tempo de choque térmico, o volume, a amostra de DNA, a tensão e o tempo de corrida nos valores iniciais.

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