Laboratorio virtual de biotecnología: transformación y gel

Este laboratorio virtual de biotecnología reúne dos investigaciones de AP Biology en una sola mesa: la transformación bacteriana y el análisis del ADN con enzimas de restricción. En la primera pestaña, los estudiantes transforman E. coli con un plásmido que lleva un gen de resistencia a la ampicilina y un gen GFP que se activa con arabinosa. Observan seis placas con luz normal y con luz UV, y calculan la eficiencia de transformación. En la segunda pestaña, cortan ADN con EcoRI, BamHI y HindIII, corren un gel de agarosa y calculan el tamaño de los fragmentos con la curva patrón de un marcador. Todos los números de esta guía se leyeron en la simulación.

Relación con el currículo

• AP Biology: Unit 6 (Gene Expression and Regulation), tema 6.8 Biotechnology (IST-1.P), con el interruptor de arabinosa como ejemplo de regulación génica (tema 6.5). Corresponde a las investigaciones de AP sobre transformación bacteriana y análisis con enzimas de restricción (Labs 8 y 9).
• Simulic no está afiliado al College Board ni a AQA, ni cuenta con su respaldo.

Antes del laboratorio (5 min)

Pregunta: "Las E. coli de los tubos + plásmido y − plásmido se siembran en placas LB, LB/amp y LB/amp/ara. ¿En qué placas habrá colonias que brillen en verde con luz UV?" Los estudiantes dan una razón. En un enlace de clase es la pregunta 1; la simulación se desbloquea cuando responden.

Método en la simulación

Parte A: transformación. Deja los valores iniciales: plásmido 0,08 µg/µL, choque térmico 50 s, 100 µL por placa.

1. En 1. Transformación, pulsa en orden cada botón de los pasos, desde Añadir CaCl₂ hasta Incubar a 37 °C. Lee el mensaje después de cada paso.
2. Arrastra Tiempo de incubación hasta 24 h.
3. Anota el crecimiento en las seis placas. Pulsa Luz UV y anota qué placas brillan.
4. Toca la placa LB/amp/ara + plásmido y luego toca cada colonia para contarla, o pulsa Contar por mí. Pulsa Volver a las 6 placas y cuenta también la placa LB/amp + plásmido.
5. Lee la eficiencia en Eficiencia de transformación, a partir de la placa LB/amp/ara.

Placa	Crecimiento	Con UV	Colonias contadas
+ plásmido, LB
+ plásmido, LB/amp
+ plásmido, LB/amp/ara
− plásmido, LB
− plásmido, LB/amp
− plásmido, LB/amp/ara

Parte B: digestión y gel. Deja 100 V, 40 min y ADN de fago. El carril 1 lleva el marcador; los carriles 2–6 llevan ADN de fago sin cortar, + EcoRI, + BamHI, + HindIII, + EcoRI + BamHI.

1. En 2. Digestión y gel, pulsa Digerir a 37 °C, Cargar pocillos, Correr el gel y luego Teñir y ver.
2. Pulsa Medir el marcador por mí para trazar la curva patrón.
3. Toca cada banda de los carriles 3–5. La tabla de muestras indica su distancia d y su tamaño según la curva.

Carril	Enzima	Número de bandas	d (mm)	Tamaño según la curva (pb)
3	EcoRI
4	BamHI
5	HindIII

Resultados esperados

Transformación. Las dos placas LB crecen como un césped, y las dos placas de ampicilina − plásmido quedan vacías. Las placas LB/amp y LB/amp/ara + plásmido dan colonias aisladas en números parecidos. Con luz UV, solo brillan en verde las colonias de LB/amp/ara. Un ensayo de prueba dio 67 y 70 colonias.

El cálculo: 0,80 µg de plásmido en 510 µL, de los que se siembran 100 µL, así que la placa recibió 0,157 µg. Entonces 70 ÷ 0,157 ≈ 450 transformantes/µg. Los recuentos varían al azar en torno a 73 por placa, así que la mayoría de los ensayos dan de 300 a 650 transformantes/µg. Si se omite el choque térmico, queda alrededor de una décima parte de las colonias.

Gel. El marcador va de 17,0 mm (10 000 pb) a 54,0 mm (250 pb). La curva es log₁₀(pb) = 4,695 − 0,0411·d (R² = 0,996, 13 puntos). EcoRI corta el fago dos veces y da 3 bandas a 18,5; 20,0 y 25,5 mm. La curva las lee como 8590, 7450 y 4430 pb; los tamaños reales son 8700, 7100 y 4200 pb. BamHI (3 sitios) da 4 bandas y HindIII (4 sitios) da 5. El punto de 250 pb queda por debajo de la recta: como en un gel real, la curva se dobla en los dos extremos, así que lee los tamaños en su parte central recta.

Preguntas para los estudiantes

1. Predicción: ¿en qué placas habrá colonias que brillen en verde con luz UV?
2. ¿Qué placa muestra que la ampicilina mata a las células sin el plásmido?
3. Cuenta la placa LB/amp/ara + plásmido. ¿Cuál es la eficiencia de transformación?
4. ADN de fago + EcoRI: ¿cuál es el tamaño de la banda más alejada del pocillo?
5. Explica por qué el ADN se mueve hacia el electrodo positivo y por qué los fragmentos más pequeños llegan más lejos.

Respuestas para el docente:

1. Solo la placa LB/amp/ara + plásmido.
2. − plásmido, LB/amp.
3. Unos 450 transformantes/µg; se acepta cualquier respuesta de 250 a 700.
4. Unos 4400 pb (real: 4200); se acepta de 3900 a 4700 pb.
5. Los grupos fosfato dan carga negativa al ADN, así que se mueve hacia el electrodo positivo. El gel de agarosa es una red de poros: los fragmentos pequeños pasan con más facilidad, así que llegan más lejos en el mismo tiempo.

Ideas erróneas frecuentes

• "La arabinosa hizo resistentes a las bacterias." La resistencia viene del gen bla del plásmido. La arabinosa solo activa el gen GFP.
• "Si no brillan en LB/amp, las células no tienen el gen GFP." El gen está, pero no se expresa sin arabinosa.
• "Tres cortes siempre dan tres fragmentos." Un ADN lineal cortado en n sitios da n + 1 fragmentos; un plásmido circular da n.
• "Los fragmentos grandes son más oscuros porque son moléculas más grandes." La intensidad de la banda depende de la masa de ADN, así que un fragmento pequeño lleva menos ADN y se ve más tenue.

Ampliación

• Optimizar el choque térmico. Usa Nuevo experimento con tiempos de choque térmico de 0 a 120 s y representa el número de colonias. El máximo está cerca de 50 s.
• Mapear el plásmido. Pon en un carril Plásmido GFP + BamHI. Dos sitios dan 2 fragmentos, de 1800 y 3600 pb. Pregunta por qué el plásmido sin cortar da dos bandas cuyo tamaño no se puede leer con el marcador.

Preguntas frecuentes

¿Sustituye esto al laboratorio real?

Sustituye las partes que muchas escuelas no pueden hacer: sin bacterias modificadas genéticamente, sin luz UV y sin tinción de ADN. Úsalo para planificar, para practicar los cálculos o en lugar de un laboratorio que no puedes hacer. Consulta laboratorios virtuales frente a laboratorios reales.

¿Por qué los estudiantes obtienen recuentos de colonias distintos?

Qué células captan el plásmido es cuestión de azar, como en un laboratorio real. Junta los resultados de la clase y calcula una eficiencia media.

¿Puedo fijar los ajustes para mi clase?

Sí. En la página Compartir, crea un enlace y fija en los valores iniciales la concentración de plásmido, el tiempo de choque térmico, el volumen, la muestra de ADN, el voltaje y el tiempo de electroforesis.

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