TP virtuel de biotechnologie : transformation et gel

Ce TP virtuel de biotechnologie réunit deux investigations d'AP Biology sur une même paillasse : la transformation bactérienne et l'analyse de l'ADN par enzymes de restriction. Dans le premier onglet, les élèves transforment E. coli avec un plasmide qui porte un gène de résistance à l'ampicilline et un gène GFP activé par l'arabinose. Ils observent six boîtes en lumière normale et sous UV, puis calculent l'efficacité de transformation. Dans le second onglet, ils coupent l'ADN avec EcoRI, BamHI et HindIII, font migrer un gel d'agarose et déterminent la taille des fragments à partir de la courbe d'étalonnage d'un marqueur de taille. Tous les nombres ci-dessous ont été lus dans la simulation.

Liens avec les programmes

• AP Biology : Unit 6 (Gene Expression and Regulation), topic 6.8 Biotechnology (IST-1.P), avec l'interrupteur arabinose comme exemple de régulation des gènes (topic 6.5). Il correspond aux investigations AP sur la transformation bactérienne et l'analyse par enzymes de restriction (Labs 8 et 9).
• Simulic n'est pas affilié au College Board ni à AQA, et n'est pas approuvé par eux.

Avant le TP (5 min)

Demandez : « Des E. coli des tubes + plasmide et − plasmide sont étalées sur des boîtes LB, LB/amp et LB/amp/ara. Quelles boîtes auront des colonies qui brillent en vert sous UV ? » Les élèves donnent une raison. Sur un lien de classe, c'est la question 1 ; la simulation se débloque une fois qu'ils ont répondu.

Protocole dans la simulation

Partie A : transformation. Gardez les valeurs de départ : plasmide à 0,08 µg/µL, choc thermique de 50 s, 100 µL par boîte.

1. Dans 1. Transformation, appuyez sur chaque bouton d'étape dans l'ordre, de Ajouter CaCl₂ à Incuber à 37 °C. Lisez le message après chaque étape.
2. Faites glisser Durée d'incubation jusqu'à 24 h.
3. Notez la croissance sur les six boîtes. Appuyez sur Lumière UV et notez quelles boîtes brillent.
4. Touchez la boîte + plasmide LB/amp/ara, puis touchez chaque colonie pour la compter, ou appuyez sur Compter pour moi. Appuyez sur Retour aux 6 boîtes et comptez aussi la boîte + plasmide LB/amp.
5. Lisez l'efficacité sous Efficacité de transformation, à partir de la boîte LB/amp/ara.

Boîte	Croissance	Sous UV	Colonies comptées
+ plasmide, LB
+ plasmide, LB/amp
+ plasmide, LB/amp/ara
− plasmide, LB
− plasmide, LB/amp
− plasmide, LB/amp/ara

Partie B : digestion et gel. Gardez 100 V, 40 min et l'ADN de phage. La piste 1 contient le marqueur de taille ; les pistes 2–6 contiennent l'ADN de phage non coupé, + EcoRI, + BamHI, + HindIII, + EcoRI + BamHI.

1. Dans 2. Digestion et gel, appuyez sur Digérer à 37 °C, Charger les puits, Lancer le gel, puis Colorer et observer.
2. Appuyez sur Mesurer le marqueur pour moi pour tracer la courbe d'étalonnage.
3. Touchez chaque bande des pistes 3–5. Le tableau des échantillons indique sa distance d et sa taille lue sur la courbe.

Piste	Enzyme	Nombre de bandes	d (mm)	Taille d'après la courbe (pb)
3	EcoRI
4	BamHI
5	HindIII

Résultats attendus

Transformation. Les deux boîtes LB donnent un tapis, et les deux boîtes à ampicilline − plasmide restent vides. Les boîtes + plasmide LB/amp et LB/amp/ara donnent des colonies isolées en nombres proches. Sous UV, seules les colonies LB/amp/ara brillent en vert. Un essai a donné 67 et 70 colonies.

Le calcul : 0,80 µg de plasmide dans 510 µL, 100 µL étalés, donc la boîte a reçu 0,157 µg. Ensuite, 70 ÷ 0,157 ≈ 450 transformants/µg. Les comptages varient au hasard autour de 73 par boîte : la plupart des essais donnent donc de 300 à 650 transformants/µg. Sauter le choc thermique laisse environ un dixième des colonies.

Gel. Le marqueur va de 17,0 mm (10 000 pb) à 54,0 mm (250 pb). La courbe est log₁₀(pb) = 4,695 − 0,0411·d (R² = 0,996, 13 points). EcoRI coupe le phage deux fois et donne 3 bandes à 18,5 ; 20,0 et 25,5 mm. La courbe les lit comme 8 590 ; 7 450 et 4 430 pb ; les tailles réelles sont 8 700 ; 7 100 et 4 200 pb. BamHI (3 sites) donne 4 bandes et HindIII (4 sites) en donne 5. Le point à 250 pb est sous la droite : comme dans un vrai gel, la courbe s'infléchit aux deux extrémités, donc lisez les tailles sur sa partie centrale droite.

Questions pour les élèves

1. Prédiction : quelles boîtes auront des colonies qui brillent en vert sous UV ?
2. Quelle boîte montre que l'ampicilline tue les cellules sans plasmide ?
3. Comptez la boîte + plasmide LB/amp/ara. Quelle est l'efficacité de transformation ?
4. ADN de phage + EcoRI : quelle est la taille de la bande la plus éloignée du puits ?
5. Expliquez pourquoi l'ADN migre vers l'électrode positive, et pourquoi les petits fragments vont plus loin.

Réponses pour l'enseignant :

1. Seulement la boîte + plasmide LB/amp/ara.
2. − plasmide, LB/amp.
3. Environ 450 transformants/µg ; toute réponse de 250 à 700 est acceptée.
4. Environ 4 400 pb (réelle : 4 200) ; de 3 900 à 4 700 pb est accepté.
5. Les groupements phosphate rendent l'ADN négatif : il migre donc vers l'électrode positive. Le gel d'agarose est un réseau de pores : les petits fragments s'y faufilent plus facilement, donc ils vont plus loin dans le même temps.

Idées fausses fréquentes

• « L'arabinose a rendu les bactéries résistantes. » La résistance vient du gène bla du plasmide. L'arabinose active seulement le gène GFP.
• « Pas de fluorescence sur LB/amp signifie que les cellules n'ont pas de gène GFP. » Le gène est présent, mais il n'est pas exprimé sans arabinose.
• « Trois coupures donnent toujours trois morceaux. » Un ADN linéaire coupé en n sites donne n + 1 fragments ; un plasmide circulaire en donne n.
• « Les gros fragments sont plus foncés parce que ce sont de plus grosses molécules. » L'intensité d'une bande suit la masse d'ADN : un petit fragment porte moins d'ADN et paraît plus pâle.

Prolongement

• Optimiser le choc thermique. Faites une Nouvelle expérience avec des chocs thermiques de 0 à 120 s et tracez le nombre de colonies. Il est maximal vers 50 s.
• Cartographier le plasmide. Réglez une piste sur Plasmide GFP + BamHI. Deux sites donnent 2 fragments, de 1 800 et 3 600 pb. Demandez pourquoi le plasmide non coupé donne deux bandes dont on ne peut pas lire la taille avec le marqueur.

Questions fréquentes

Cela remplace-t-il le TP réel ?

Il remplace les parties que les établissements ne peuvent souvent pas faire : pas de bactéries génétiquement modifiées, pas de lumière UV et pas de colorant d'ADN. Utilisez-le pour préparer, pour s'entraîner aux calculs, ou à la place d'un TP impossible à réaliser. Voir laboratoires virtuels ou réels.

Pourquoi les élèves obtiennent-ils des nombres de colonies différents ?

Les cellules qui absorbent le plasmide sont choisies au hasard, comme dans un vrai laboratoire. Mettez en commun les résultats de la classe et calculez une efficacité moyenne.

Puis-je fixer les réglages pour ma classe ?

Oui. Dans la page de partage, créez un lien et réglez la concentration du plasmide, la durée du choc thermique, le volume, l'échantillon d'ADN, la tension et la durée de migration dans les valeurs de départ.

Voir aussi

PCR – amplification de l'ADN par cycles thermiques Expression des gènes – transcription, traduction et régulation

Pour la régulation des gènes, voir le plan de cours sur l'expression des gènes. Pour la technique aseptique, voir le TP virtuel zones d'inhibition.