Biotechnologie im virtuellen Labor: Transformation und Gel

Dieses Material zeigt Biotechnologie im virtuellen Labor und vereint zwei Untersuchungen aus AP Biology auf einem Labortisch: bakterielle Transformation und Restriktionsanalyse von DNA. Im ersten Tab transformieren die Lernenden E. coli mit einem Plasmid, das ein Ampicillin-Resistenzgen und ein GFP-Gen trägt, das Arabinose einschaltet. Sie betrachten sechs Platten bei Raum- und UV-Licht und berechnen die Transformationseffizienz. Im zweiten Tab schneiden sie DNA mit EcoRI, BamHI und HindIII, lassen ein Agarosegel laufen und bestimmen die Fragmentgrößen mit der Eichkurve eines DNA-Größenstandards. Jede Zahl unten wurde in der Simulation abgelesen.

Lehrplanbezug

• AP Biology: Unit 6 (Gene Expression and Regulation), Thema 6.8 Biotechnologie (IST-1.P), mit dem Arabinose-Schalter als Beispiel für Genregulation (Thema 6.5). Das Material passt zu den AP-Untersuchungen zur bakteriellen Transformation und zur Restriktionsanalyse (Labs 8 und 9).
• Simulic ist weder mit dem College Board noch mit AQA verbunden und wird von ihnen nicht unterstützt.

In Deutschland passt das Material zur Gentechnik im Biologieunterricht der Oberstufe.

Vor dem Experiment (5 min)

Fragen Sie: „E. coli aus den Röhrchen + Plasmid und − Plasmid wird auf LB-, LB/amp- und LB/amp/ara-Platten ausplattiert. Auf welchen Platten leuchten Kolonien unter UV-Licht grün?“ Die Lernenden nennen einen Grund. Auf einem Klassenlink ist das Frage 1; die Simulation wird freigegeben, sobald sie geantwortet haben.

Durchführung in der Simulation

Teil A: Transformation. Behalten Sie die Startwerte bei: Plasmid 0,08 µg/µL, Hitzeschock 50 s, 100 µL je Platte.

1. Klicken Sie in 1. Transformation die Schritt-Schaltflächen der Reihe nach an, von CaCl₂ zugeben bis Bei 37 °C bebrüten. Lesen Sie nach jedem Schritt die Meldung.
2. Ziehen Sie Bebrütungszeit auf 24 h.
3. Notieren Sie das Wachstum auf allen sechs Platten. Klicken Sie auf UV-Licht und notieren Sie, welche Platten leuchten.
4. Tippen Sie die LB/amp/ara-Platte von + Plasmid an und tippen Sie dann jede Kolonie an, um sie zu zählen, oder klicken Sie auf Für mich zählen. Klicken Sie auf Zurück zu 6 Platten und zählen Sie auch die LB/amp-Platte von + Plasmid.
5. Lesen Sie die Effizienz unter Transformationseffizienz ab, berechnet aus der LB/amp/ara-Platte.

Platte	Wachstum	Unter UV	Gezählte Kolonien
+ Plasmid, LB
+ Plasmid, LB/amp
+ Plasmid, LB/amp/ara
− Plasmid, LB
− Plasmid, LB/amp
− Plasmid, LB/amp/ara

Teil B: Verdau und Gel. Behalten Sie 100 V, 40 min und Phagen-DNA bei. Spur 1 enthält den Größenstandard; die Spuren 2–6 enthalten Phagen-DNA ungeschnitten, + EcoRI, + BamHI, + HindIII, + EcoRI + BamHI.

1. Klicken Sie in 2. Verdau und Gel auf Verdau bei 37 °C, Taschen beladen, Gel laufen lassen und dann auf Färben und ansehen.
2. Klicken Sie auf Standard für mich messen, um die Eichkurve zu zeichnen.
3. Tippen Sie jede Bande in den Spuren 3–5 an. Die Probentabelle zeigt ihre Laufstrecke d und ihre Größe aus der Kurve.

Spur	Enzym	Zahl der Banden	d (mm)	Größe aus der Kurve (bp)
3	EcoRI
4	BamHI
5	HindIII

Erwartete Ergebnisse

Transformation. Beide LB-Platten zeigen einen Bakterienrasen, und beide Ampicillin-Platten von − Plasmid bleiben leer. Die LB/amp- und LB/amp/ara-Platten von + Plasmid zeigen einzelne Kolonien in ähnlicher Zahl. Unter UV leuchten nur die Kolonien auf LB/amp/ara grün. Ein Testlauf ergab 67 und 70 Kolonien.

Die Rechnung: 0,80 µg Plasmid in 510 µL, davon 100 µL ausplattiert, also erhielt die Platte 0,157 µg. Dann 70 ÷ 0,157 ≈ 450 Transformanten/µg. Die Zahl schwankt zufällig um 73 pro Platte, daher ergeben die meisten Läufe 300 bis 650 Transformanten/µg. Ohne Hitzeschock bleibt etwa ein Zehntel der Kolonien.

Gel. Der Größenstandard reicht von 17,0 mm (10.000 bp) bis 54,0 mm (250 bp). Die Kurve lautet log₁₀(bp) = 4,695 − 0,0411·d (R² = 0,996, 13 Punkte). EcoRI schneidet die Phagen-DNA zweimal und ergibt 3 Banden bei 18,5, 20,0 und 25,5 mm. Die Kurve liest sie als 8.590, 7.450 und 4.430 bp ab; die echten Größen sind 8.700, 7.100 und 4.200 bp. BamHI (3 Schnittstellen) ergibt 4 Banden und HindIII (4 Schnittstellen) 5. Der Punkt bei 250 bp liegt unter der Geraden: Wie bei einem echten Gel krümmt sich die Kurve an beiden Enden, lesen Sie die Größen also aus ihrem geraden Mittelteil ab.

Fragen für die Lernenden

1. Vorhersage: Auf welchen Platten leuchten Kolonien unter UV-Licht grün?
2. Welche Platte zeigt, dass Ampicillin Zellen ohne das Plasmid tötet?
3. Zählen Sie die LB/amp/ara-Platte von + Plasmid. Wie groß ist die Transformationseffizienz?
4. Phagen-DNA + EcoRI: Wie groß ist die Bande, die am weitesten von der Tasche entfernt ist?
5. Erklären Sie, warum DNA zum Pluspol wandert und warum kleinere Fragmente weiter laufen.

Antworten für Lehrkräfte:

1. Nur die LB/amp/ara-Platte von + Plasmid.
2. − Plasmid, LB/amp.
3. Etwa 450 Transformanten/µg; jede Antwort von 250 bis 700 wird akzeptiert.
4. Etwa 4.400 bp (echt 4.200); 3.900 bis 4.700 bp werden akzeptiert.
5. Phosphatgruppen machen DNA negativ, daher wandert sie zum Pluspol. Das Agarosegel ist ein Netz aus Poren: Kleine Fragmente schlüpfen leichter hindurch und laufen daher in derselben Zeit weiter.

Häufige Fehlvorstellungen

• „Die Arabinose hat die Bakterien resistent gemacht.“ Die Resistenz stammt vom bla-Gen auf dem Plasmid. Arabinose schaltet nur das GFP-Gen ein.
• „Kein Leuchten auf LB/amp bedeutet, dass die Zellen kein GFP-Gen haben.“ Das Gen ist vorhanden, wird ohne Arabinose aber nicht exprimiert.
• „Drei Schnitte ergeben immer drei Stücke.“ Lineare DNA, die an n Stellen geschnitten wird, ergibt n + 1 Fragmente; ein ringförmiges Plasmid ergibt n.
• „Größere Fragmente sind dunkler, weil sie größere Moleküle sind.“ Die Dunkelheit einer Bande folgt der DNA-Masse; ein kleines Fragment trägt weniger DNA und wirkt daher blasser.

Erweiterung

• Den Hitzeschock optimieren. Führen Sie mit Neuer Versuch Hitzeschockzeiten von 0 bis 120 s durch und tragen Sie die Kolonienzahl auf. Sie erreicht ihr Maximum bei etwa 50 s.
• Das Plasmid kartieren. Stellen Sie eine Spur auf GFP-Plasmid + BamHI. Zwei Schnittstellen ergeben 2 Fragmente, 1.800 und 3.600 bp. Fragen Sie, warum das ungeschnittene Plasmid zwei Banden ergibt, deren Größe sich nicht am Standard ablesen lässt.

Häufige Fragen

Ersetzt das den echten Laborversuch?

Es ersetzt die Teile, die Schulen oft nicht durchführen können: keine gentechnisch veränderten Bakterien, kein UV-Licht und kein DNA-Farbstoff. Nutzen Sie es zum Planen, zum Üben der Rechnungen oder anstelle eines Versuchs, den Sie nicht durchführen können. Siehe virtuelle Labore und echte Labore im Vergleich.

Warum zählen die Lernenden unterschiedlich viele Kolonien?

Welche Zellen das Plasmid aufnehmen, ist Zufall, wie im echten Labor. Fassen Sie die Ergebnisse der Klasse zusammen und berechnen Sie eine mittlere Effizienz.

Kann ich die Startwerte für meine Klasse festlegen?

Ja. Erstellen Sie auf der Seite Teilen einen Link und legen Sie in den Startwerten Plasmidkonzentration, Hitzeschockdauer, Volumen, DNA-Probe, Spannung und Laufzeit fest.

Verwandte Simulationen und Leitfäden

PCR – Vervielfältigung von DNA durch Temperaturzyklen Genexpression – Transkription, Translation und Regulation

Zur Genregulation siehe den Unterrichtsplan zur Genexpression. Zur sterilen Arbeitstechnik siehe das virtuelle Labor zu Hemmhöfen.