PCR – amplificação de DNA por ciclos térmicos

O que mostra

A reação em cadeia da polimerase copia um trecho curto de DNA-alvo. Em cada ciclo térmico as fitas se separam, dois primers se ligam às extremidades do alvo e uma polimerase termoestável sintetiza novas fitas complementares, de modo que o número de cópias idealmente dobra: N = N₀·2ⁿ após n ciclos. Depois a curva se estabiliza quando primers, nucleotídeos e enzima se esgotam. A especificidade depende da temperatura de anelamento em relação à temperatura de fusão do primer (cerca de 60 °C aqui), e o ciclo em que o sinal cruza o limiar de detecção, o Ct, reflete a quantidade inicial de DNA-alvo.

Como usar

Clique em “Avançar um ciclo ▶” para acompanhar a desnaturação, o anelamento e a extensão no painel Programa térmico. Depois aumente o Número de ciclos e observe a curva de cópias e a banda no gel. Ajuste a Temperatura de anelamento bem acima e bem abaixo de 60 °C e compare a canaleta da amostra. Por fim, reduza o Número inicial de cópias de DNA (log) um passo de cada vez e anote como o Ct muda.

Parâmetros que você pode mudar

• Número de ciclos 0–40
• Temperatura de anelamento 40–70 °C
• Número inicial de cópias de DNA (log) 0–6

Perguntas para explorar

1. Por que o número de cópias deixa de dobrar depois de uns 30 ciclos?
2. O que acontece com o produto e a banda no gel quando a temperatura de anelamento fica muito acima da temperatura de fusão do primer?
3. Como o Ct muda quando a quantidade inicial de DNA cai dez vezes, e por quê?