PCR – amplification de l'ADN par cycles thermiques
BiologieBiotechnologies17–18 ans
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À suivre dans Biotechnologies
Chaque cycle de PCR comprend une dénaturation à 95 °C, une hybridation des amorces et une élongation à 72 °C, et double le nombre de copies du fragment d'ADN cible. Réglez le nombre de cycles, la température d'hybridation par rapport à la température de fusion des amorces et le nombre initial de copies pour voir la courbe exponentielle atteindre un plateau, la bande du gel devenir plus brillante et une bande de produit non spécifique apparaître quand la température d'hybridation est trop basse — la base des tests PCR et des empreintes génétiques.
Leçon : Biologie moléculaire
Ce qu’elle montre
L'amplification en chaîne par polymérase copie un court fragment d'ADN cible. À chaque cycle thermique, les deux brins se séparent, deux amorces se fixent aux extrémités de la cible et une polymérase thermostable synthétise de nouveaux brins complémentaires : le nombre de copies double idéalement, N = N₀·2ⁿ après n cycles. La courbe plafonne ensuite quand amorces, nucléotides et enzyme s'épuisent. La spécificité dépend de la température d'hybridation comparée à la température de fusion de l'amorce (environ 60 °C ici), et le cycle où le signal franchit le seuil de détection, le Ct, reflète la quantité initiale d'ADN cible.
Mode d’emploi
Cliquez sur « Avancer d'un cycle ▶ » pour suivre dénaturation, hybridation et élongation dans le panneau Programme thermique. Augmentez ensuite le Nombre de cycles et observez la courbe des copies et la bande sur le gel. Réglez la Température d'hybridation nettement au-dessus puis nettement au-dessous de 60 °C et comparez la piste de l'échantillon. Enfin, diminuez le Nombre initial de copies d'ADN (log) pas à pas et notez l'évolution du Ct.
Paramètres modifiables
- Nombre de cycles 0–40
- Température d'hybridation 40–70 °C
- Nombre initial de copies d'ADN (log) 0–6
Questions à explorer
- Pourquoi le nombre de copies cesse-t-il de doubler après environ 30 cycles ?
- Que deviennent le produit et la bande sur le gel quand la température d'hybridation dépasse nettement la température de fusion de l'amorce ?
- Comment le Ct change-t-il quand la quantité initiale d'ADN est divisée par dix, et pourquoi ?
