PCR – amplificación de ADN por ciclos térmicos
BiologíaBiotecnologíaEdades 17–18
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Cada ciclo de PCR consta de desnaturalización a 95 °C, hibridación de los cebadores y extensión a 72 °C, y duplica el número de copias del segmento de ADN diana. Ajusta el número de ciclos, la temperatura de hibridación respecto a la temperatura de fusión del cebador y el número inicial de copias para ver cómo la curva exponencial llega a una meseta, la banda del gel se hace más brillante y aparece una banda de subproducto inespecífico cuando la temperatura de hibridación es demasiado baja: la base de las pruebas PCR y de la genética forense.
Lección: Biología molecular
Qué muestra
La reacción en cadena de la polimerasa copia un fragmento corto de ADN diana. En cada ciclo térmico las hebras se separan, dos cebadores se unen a los extremos de la diana y una polimerasa termoestable sintetiza nuevas hebras complementarias, así que el número de copias idealmente se duplica: N = N₀·2ⁿ tras n ciclos. Después la curva se estabiliza cuando se agotan cebadores, nucleótidos y enzima. La especificidad depende de la temperatura de hibridación respecto a la temperatura de fusión del cebador (unos 60 °C aquí), y el ciclo en que la señal cruza el umbral de detección, Ct, refleja la cantidad inicial de ADN diana.
Cómo usarla
Pulsa «Avanzar un ciclo ▶» para seguir la desnaturalización, la hibridación y la extensión en el panel Programa térmico. Luego aumenta el Número de ciclos y observa la curva de copias y la banda del gel. Ajusta la Temperatura de hibridación muy por encima y muy por debajo de 60 °C y compara el carril de la muestra. Por último, reduce las Copias iniciales de ADN (log) paso a paso y anota cómo cambia el Ct.
Parámetros que puedes cambiar
- Número de ciclos 0–40
- Temperatura de hibridación 40–70 °C
- Copias iniciales de ADN (log) 0–6
Preguntas para explorar
- ¿Por qué el número de copias deja de duplicarse después de unos 30 ciclos?
- ¿Qué ocurre con el producto y la banda del gel si la temperatura de hibridación supera mucho la temperatura de fusión del cebador?
- ¿Cómo cambia el Ct cuando la cantidad inicial de ADN se reduce diez veces, y por qué?
